Анисимов Валентин Вадимович

доктор медицинских наук
хирург-онколог высшей категории
Онколог, хирург-онколог Анисимов Валентин Вадимович

Опыт применения фотодинамической терапии в хирургическом лечении первичных и рецидивных меланом кожи

Авторы: Мяснянкин Михаил Юрьевич, Гафтон Георгий Иванович, Анисимов Валентин Вадимович, Гельфонд Марк Львович, Балдуева Ирина Александровна

ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова» Минздрава России, г. Санкт-Петербург

Научные руководители:
доктор медицинских наук,
профессор
Георгий Иванович Гафтон
доктор медицинских наук,
Ирина Александровна Балдуева

Список сокращений:

  1. BD CellQuest Pro – универсальная программа для цитометрических исследований для проточного цитофлуориметра BD FACSCalibur
  2. FACSCalibur – цитофлуориметр проточный - система с широким спектром приложений
  3. MHC I – Major histocompatibility complex I (Главный комплекс гистосовместимости I)
  4. 95% ДИ – доверительный интервал
  5. АИ – апоптотический индекс
  6. ИМ – иммунный статус
  7. МКА – моноклональные антитела
  8. неоадъювантная ФДТ – дооперационная фотодинамическая терапия
  9. ОАА – опухолеассоциированные антигены
  10. ФДТ – фотодинамическая терапия
  11. ФД-воздействие – фотодинамическое воздействие

1. Введение

В настоящее время фотодинамическая терапия (ФДТ) наряду с хирургическим, лучевым методами и химиотерапией признана альтернативным методом лечения злокачественных новообразований. ФДТ – это локо-регионарный органосохраняющий метод лечения, открывающий широкие возможности воздействия на опухолевые клетки как прямого цитотоксического действия, так и активированного противоопухолевого каскада иммунологических реакций.

Меланома – это одна из самых агрессивных злокачественных опухолей, частота, которой постепенно увеличивается, а методы лечения далеко не всегда оказываются эффективными. Лекарственное лечение больных с диссеминированной меланомой кожи во второй и последующих линиях терапии представляет собой клинически важную и практически нерешенную задачу. Значительное увеличение уровня заболеваемости меланомой кожи с высоким риском микрометастазов до хирургического лечения определяет важность проблемы поиска принципиально новых методов системного лечения. Наиболее перспективным в этом плане представляется использование фотодинамической терапии (ФДТ) у больных с данной онкопатологией кожи.

Исследования показали, что суть метода заключается в том, что фотосенсибилизатор, селективно накапливающийся в тканях с повышенным метаболизмом, активируется путем локального облучения патологически измененных тканей светом с длиной волны, соответствующей длинноволновому пику поглощения фотосенсибилизатора. Возникающая в присутствии кислорода тканей фотохимическая реакция вызывает генерацию синглетного и других активных форм кислорода, губительно действующих на опухолевые клетки, что приводит к резорбции опухоли и абластики в ложе опухоли (Красновский А.А., 2004). Действие активных форм кислорода помимо прямого цитотоксического повреждения опухолевых клеток, оказывают деструкцию питающих опухоль кровеносных сосудов. Кроме того, ФДТ является «пусковым» механизмом в активации противоопухолевого иммунного ответа, связанного с усилением процесса апоптоза опухолевых клеток, а так же с развитием острой воспалительной реакции и распознаванием CD8+ Т-лимфоцитами MHC I* рестриктированных эпитопов опухолеассоциированных антигенов (ОАА) (Балдуева И.А., 2001; Gollnik S.O., Brackett C.M., 2010, 2011; Preise D. et al., 2011)., а субтканевая гибель опухолевых клеток, которые фагоцитируются, процессируются и презентируются макрофагами и дендритными клетками «наивным» Т-лимфоцитам в лимфатических узлах (Huang Z. et al., 2008; Mroz P. et al., 2010).

1.1. Цель исследования

Улучшение результатов лечения первичных и рецидивных меланом кожи с использованием фотодинамической терапии.

1.2. Задачи исследования

  1. Изучить индукцию апоптоза клеток меланомы кожи человека под влиянием ФДТ в эксперименте in vitro.
  2. Оценить воздействие операции с или без ФДТ на субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток периферической крови у больных меланомой кожи.
  3. Оценить субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток у больных меланомой кожи.
  4. Сравнить отдаленные результаты общей и безрецидивной выживаемости радикально пролеченных больных меланомой кожи с и без ФДТ в лечении.
  5. Анализ эффективности ФДТ в хирургическом лечении больных меланомой кожи

1.3. Научная новизна

В работе впервые:

1.4. Научно-практическая значимость

1.5. Внедрение результатов работы в практику

Результаты работы внедрены и используются в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт онкологии имени Н.Н. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации при диагностике и планировании системного лечения меланомы кожи у пациентов с учетом клинических и биологических особенностей опухолей, что позволило повысить эффективность лечения меланомы кожи у пациентов путем создания алгоритма диагностики и рекомендаций по системному лечению в зависимости от клинических, морфологических и биологических особенностей опухоли.

2. Основная часть

2.1. Материалы и методы

В соответствии с задачами исследования, работа была разделена на две части: экспериментальную и клиническую.

2.1.1. Методика экспериментального исследования

Для экспериментального исследования in vitro использовали клеточную линию меланомы кожи человека (Mel 226), полученную в лаборатории клеточных технологий отделения химиотерапии и инновационных клеточных технологий и депонированную в Российском Банке клеточных линий позвоночных. ФД добавляли в разных концентрациях: 1) 0,5 мкг/мл, 2) 1мкг/мл (эквивалент дозе 1 мг/кг, рекомендованной в инструкции по применению ФД), 3) 2,5 мкг/мл. Через 30 мин проводили облучение клеток меланомы лазерным светом 662 нм, 40 Дж (доза для культуры опухолевых клеток, эквивалентная используемой в клинической практике), экспозиция 6 и 10 мин. Анализ проводили через 1 и 4 часа после фотодинамического воздействия. К полученной суспензии клеток (1×106/мл) добавляли аннексин V-FITC (Annexin V-FITC, FITC (Fluorescein Isothiocyanate)) («BD», USA) и пропидиум йодид (PI (Propidium Iodide)) («BD», USA), инкубировали 15 мин в темноте, при комнатной температуре. Подсчет клеток проводили с использованикм флуоресцентного микроскопа («Carl Zeiss», Германия). Уровень апоптоза оценивали по апоптотическому индексу (АИ). Данный параметр характеризует относительное число клеток с характерными морфологическими или биохимическими признаками и определяется по формуле 1:

[1] АИ = Количество апоптотических клеток / Общее кол-во клеток X 100%

АИ учитывали раздельно для всех анализируемых клеток на стадии «раннего» и «позднего» апоптоза (рис.1 в приложении).

2.1.Методика клинического исследования

В клиническую часть исследование были включены пациенты, получавшие лечение в ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России с июля 2012 г. по январь 2015 г., и соответствующие следующим требованиям:

Критериями включения в исследование были:

Критериями невключения в исследование были:

Клиническая часть была разбита на два подраздела: для оценки иммунологических показателей и для клинической оценки отдаленных результатов лечения.

2.1.2.1. Оценка субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток у больных меланомой кожи проводилась по схеме, представленной на рисунке 2 (рис.2 в приложении).

Всем больным проводился забор крови для оценки содержания основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови до лечения и через 7 дней после операции. Иммунофенотипический анализ проводили на проточном лазерном цитофлуориметре BD FACSCalibur (tm) (BD Biosciense). Для окрашивания клеток использовали панель МКА меченых FITC (изотиоцианат флуоресцеина, PE (фикоэритрин), PC5 (комплекс PE с цианином-5), PerCP (перидинин-хлорофилл протеин) или PerCP-Cy5.5 (комплекс PerCP с цианином 5.5) к белкам-маркерам (CD) клеточной мембраны лейкоцитов. Проводили регистрацию прямого светорассеяния (под углами 1-10о), бокового светорассеяния (под углом 90о). Для каждого образца анализировали не менее 105 клеток. Для оценки данных иммунофенотипического анализа использовали программное обеспечение CellQuest Pro (tm).

Пациенты в соответствии с этим распределены на две группы. Хирургическое лечение больных (1-я гр.) проводили по стандартной методике в объеме радикального хирургического вмешательства. Второй группе пациентов за 2 дня до хирургического лечения или за 2 часа в день операции проводили ФДТ отечественным ФС второго поколения - диметилглюкаминовая соль хлорина Е6 (фотодитазин, регистрационный номер №249188), 50,0 мг внутривенно капельно в течение 30 мин в 200 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Через 2 часа после этого проводили лазерное облучение опухолевого очага (662 нм, 400 Дж), а тем, кто оперировался в тот же день – лазерное облучение проводили после удаления локализованной опухоли и/или метастатического поражения регионарных лимфатических узлов в течение 30 минут. С начала введения и в последующие 24 часа пациенты носили солнцезащитные очки.

В исследование включено 45 больных локализованной меланомой кожи. Характеристика пациентов представлена в табл. 1.

Как видно из табл. 1, пациенты, в изучаемых группах были сопоставимы по возрасту и полу, а также по стадиям заболевания.

При анализе субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток учитывали абсолютное содержание Т-лимфоцитов (CD3+CD19-), Т-хелперов (CD3+CD4+), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+), двойных положительных Т-клеток (CD3+CD4+CD8+), В-лимфоцитов (CD19+CD3-), активированных Т-хелперов (CD3+CD4+HLA DR+).

Иммунокомпетентные клетки изучали по экспрессии дифференцировочных антигенов, описанной выше.

2.1.2.2. Оценка результатов лечения проводилась путем сравнения с прогностически однородной группой пациентов сопоставимой по половозрастному составу, клинико-морфологической характеристики первичной или рецидивной опухоли, и получивших только хирургическое лечение. Количество, получивших только хирургическое лечение пациентов равнялось 42 (1-я группа)

ФДТ и хирургическое лечение первичной или рецидивной меланомы кожи были применены у 42 пациентов с морфологически верифицированной первичной меланомой кожи (2-я группа).

Характеристика пациентов, включенных в исследование представлена в таблице 2.

2.1.3. Методика флуоресцентной диагностики меланомы кожи

Медицинская технология флуоресцентной диагностики и навигации предусматривает применение оригинального комплекса производства ЗАО «Полупроводниковые приборы» (Санкт-Петербург) для диагностики и неоадъювантной ФДТ при лечении меланомы кожи. В состав комлекса входят источник лазерного излучения, система видеорегистрации фотолюминесценции фотосенсибилизатора (ФФ) и специальное программное обеспечение, устанавливаемое на персональный компьютер. Диагностический комплекс, принцип действия которого основан на регистрации флуоресценции фотосенсибилизатора, накопившегося в патологически измененных тканях, позволяет формировать оптимальные поля лазерного облучения, наблюдать на мониторе компьютера, как сам факт накопления препарата, так и регистрировать пространственное распределение фотосенсибилизатора (с помощью гистограммы в 3D режиме) в ткани опухоли и его выгорание (фотобличинг) в процессе фотодинамической терапии (рис.3, рис.4. в приложении).

2.1.4. Методика статистической обработки данных

Для статистической обработки данных использовали методы описательной статистики: расчет 95% доверительного интервала (ДИ) для апоптотического индекса, значимость различий между сравниваемыми группами определялась с помощью критериев Wilkokson при оценке иммунологических показателей, на основании расчетов показателей выживаемости с помощью метода множительных оценок Kaplan-Meier построены графические изображения, удобные для наглядного представления информации. Расчеты проводили с использованием программы SPSS v.17. В исследовании статистически достоверным считалось значение p≤0,05.

3. Результаты

3.1. Изучение уровня апоптоза в клетках меланомы после фотодинамического воздействия (ФД-воздействие)

Результаты подсчета АИ для клеток через 1 и 4 часа после ФД-воздействия представлены на рис. 5 и рис. 6 соответственно (в приложении).

Как видно из представленных данных, концентрации ФС 0,5 мкг/мл, 1мкг/мл и 2,5 мкг /мл обладают сопоставимой способностью индуцировать ранний апоптоз. Вместе с тем, статистически значимых различий не было выявлено (р>0,05). При увеличении времени облучения ФДТ сенсибилизированного опухолевого очага происходит более быстрый переход опухолевых клеток в позднюю фазу апоптоза (р<0,05).

3.2. Оценка нежелательных явлений ФДТ

Из осложнений и нежелательных явлений у больных, получавших ФДТ, отмечалась локальная гиперемия в «зоне засветки».

3.3. Анализ динамики иммунологических показателей у больных меланомой кожи, получавших хирургическое лечение с или без ФДТ

Содержание основных субпопуляций лимфоцитов до и после хирургического лечения представлено в табл. 3 (в приложении).

Как видно из представленных данных у больных 1-й группы, хирургическое вмешательство не приводило к повышению абсолютного содержания никаких иммунологических показателей, субпопуляционный состав Т-лимфоцитов, Т-клеток ( CD3+CD19- , активированных Т-хелперов (CD3+CD4+HLADR+), Т-эффекторов (CD3+ CD8+), CD3-CD16+ CD56+ и число В-лимфоцитов (CD19+CD3-) не претерпело статистически значимых изменений (р>0,05).

При добавлении к хирургическому лечению неоадъювантной или интраоперационной ФДТ (2-я гр. больных) выявлено статистически значимое повышение содержание CD3+CD19- (р=0,019), CD3+ CD8+ Т-эффекторов (р=0,026), активированных CD3+ CD4+HLADR+ Т-хелперов (р=0,05), CD3-CD16+ CD56+ (р=0,002) В-лимфоцитов CD19+CD3- (р=0,021), что свидетельствует об активации Т- и В-клеточного звена иммунной системы.

3.4. Оценка общей и безрецидивной выживаемости больных меланомой кожи после хирургического и комбинированного лечения (ФДТ+операция)

Как видно из рисунка 7, статистически достоверно имеют наилучшие показатели общей выживаемости пациентов во 2-ой группе (р=0,001). Медиана общей выживаемости больных, составила 30 месяцев. Трехлетняя общая выживаемость больных, составила в 1-ой группе 50%, а в группе пролеченных радикально с использование ФДТ – 92 %.

Как следует из рисунка 8, статистически достоверно (р=0,0001) имеют лучшие показатели безрецидивной выживаемости пациенты, получившие хирургическое лечение с ФДТ. Показатели трехлетней безрецидивной выживаемости во второй группе равняются 82 %, тогда как в первой группе пациенты имели рецидив в 53 %.

4. Обсуждение

Механизм действия ФДТ основан на избирательном накоплении фотосенсибилизатора в опухолевой ткани. Молекулы ФС избирательно фиксируются на мембранах опухолевых клеток и митохондриях, при облучении опухоли лазером происходит переход нетоксичного триплетного кислорода в синглетный кислород, обладающий выраженным цитотоксическим действием, что приводит к разрушению мембран опухолевых клеток. Ряд биомолекул, входящих в состав мембран (ненасыщенные жирные кислоты, холестерин, триптофан, метионин, гистидин) быстро реагируют с синглетным кислородом, поэтому мембраны считаются первичными мишенями, повреждение которых ведет к повреждению и гибели клеток, через механизмы апоптоза, важную роль в котором играет фосфатидилсерин (выявляется с помощью белка аннексина V-FITC). Кроме того наблюдается усиление экспрессии ОАА и активация иммунного ответа.

В нашем исследовании показано, что ФД-воздействие с низкой мощностью приводит к иммуностимулирующему эффекту, и дальнейшее увеличение концентрации ФС и удлинение времени облучения не имеет значения. Вследствие этого в клинической практике возможно снижение дозы ФД в 2 раза, что позволяет снизить не желательную токсичность лечения.

Фотодинамическая терапия действует как локальная травма для биологического объекта, вызывая хемотаксис нейтрофиллов и активацию С3 компонента коплемента. В результате опухолевая ткань инфильтрируется нейтрофилами, под влиянием ряда цитокинов запускается множество каскадов иммунных реакций и стимулируется неспецифический и специфический иммунный ответ. Эти моменты изучены и описаны в многочисленных работах Gollnik S.O., Brackett C.M., (2010, 2011); Preise D. et al., (2011).

Оценено содержание основных субпопуляций лимфоцитов в крови больных меланомой кожи.

При хирургическом лечении не отмечается активация Т- и В-лимфоцитов. Напротив, ФДТ в хирургическом лечении больных меланомой кожи активирует Т-клеточное звено иммунной системы (увеличение абсолютного содержания Т-хелперов CD3+CD8+ ,активированных Т-лимфоцитов CD3+CD4‾HLADR+ , CD3+CD19- , Т-хелперов CD3-CD16+ CD56+ , и В-клеточного звена (повышение числа CD19+CD3-). Отмечается тенденция к увеличению содержания Таким образом, наблюдается отчетливая активация как Т-клеточного, так и В-клеточного звена иммунной системы. Вероятнее всего, это происходит вследствие апоптоза, который запускает выраженный противоопухолевый иммунный ответ, описанный Gollnik S.O., Brackett C.M. (2010); D. Preise и соавт. (2011).

Исходя из вышеизложенного анализа клинической эффективности применения в хирургическом лечении фотодинамической терапии выявляются лучшие показатели общей и безрецидивной выживаемости именно у больных, пролеченных таким методом лечения.

5.Заключение

Таким образом, проведенное экспериментальное и клиническое исследование позволило сформулировать следующие выводы:

  1. Увеличение концентрации фотодитазина не приводит к увеличению количества клеток на стадии раннего апоптоза (р>0,05).
  2. Удлинение времени экспозиции приводит к увеличению доли поздних форм апоптоза (p<0,05).
  3. Изучен субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток у больных меланомой кожи.
  4. ФДТ помимо фотохимического воздействия на опухолевые клетки меланомы кожи может служить триггером формирования протективного иммунного ответа.
  5. Использование ФДТ с фотодитазином в дозе 50,0 мг с последующим облучением (662 нм, 400 Дж) способствует активации Т- и В-клеточного звена иммунной системы (р<0,05).
  6. Общая и безрецидивная выживаемость больных меланомой кожи после хирургического лечения с ФДТ статистически имеют лучшие показатели, по сравнению с только прооперированными пациентами.
  7. Использование ФДТ в хирургическом лечении первичных и рецидивных меланом кожи улучшают результаты лечения.

6. Практические рекомендации

При определении лечебной тактики у больных первичной или рецидивной меланомой кожи целесообразно использование ФДТ в сочетании с хирургическим лечением.

Атлас

Меланома кожи часть I

Меланома кожи часть II

Сборник гл. III, VIII

Специальность 14.00.14

Статьи

Наука

Галерея

ЗАПИСАТЬСЯ НА ПРИЕМ